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概述:
定点突变试剂盒可以在克隆于质粒DNA序列的特定位点诱导突变。理论上可以保证突变率达到100%。整个实验过程简单快捷只需要两个步骤。试剂盒不需要用到M13载体和甲基化步骤。该试剂盒可以诱导某个已知基因的特定碱基进行定点突变、 再突变成野生型、密码子突变、插入或者缺失等,因此可以用于功能基因组学和蛋白质组学的研究。另外由于试剂盒能够诱导特异基因突变,又可以应用于蛋白质工程学研究领域。定点突变试剂盒操作十分简单(根据我们提供的引物设计原则设计引物;用Muta-directTM酶进行15~18个循环的PCR扩增反应;MutazymeTM酶处理选择突变克隆;转化)。理论上在LB平板上的克隆100%是突变克隆,通过对突变克隆的测序分析,正确的突变可以应用于后续实验。

目录号 规格 价格
SDM-15 15次 950元

产品特点:

操作简便,无需特殊的实验技能
2~3天即可完成基因的定点突变
整个实验过程只需要用到两种酶:Muta-directTM ?酶和MutazymeTM酶
使用范围广泛:可以用于点突变(P o i n t mutation)、缺失突变(Deletion)和插入突变 (Insertion)等
100%的突变效率

贮存条件:
请将试剂盒中提供的各种试剂贮存于-20℃。由于试剂盒中提供的反应缓冲液及dNTP是为反应专门优化的,所以不要用其它的反应缓冲液及dNTP代替。

试剂盒组成: 
试剂盒提供的对照模板及引物,可以完成5次对照实验。包括对照反应在内,本试剂盒共可进行10815次基因定点突变反应(每次反应体系50μl)。

组成 次量
Muta -DirectTMEnzyme (2.5U/μl) 15μl
Muta-DirectTMReaction Buffer (10×) 100μl
dNTP Mixture 30μl
pUC18 Control Plasmid (10ng/μl) 10μl
Control Primer Mix (20pmol/μl) 10μl
Competent cells Not provided

定点突变对照实验:

试剂盒中提供的对照质粒为pUC18,通过它可 以判断实验的成功与否。pUC18质粒包含Lac Z基因,用试剂盒中提供的对照引物可以诱导pUC18中丝氨酸(TCG)突变为终止密码子(TAG),这样会导致Lac Z基因失活,因此LB平板上的克隆必须都为白色才证明突变成功。对于首次做突变实验的用 户,可以通过对照反应观察实验是否成功。

引物设计:

首先需要进行引物设计,设计时请参考如下原则:
通常引物长度为25~45mer,我们建议引物长度 为 30~35mer。
注:突变位点应该设计在引物的中央位置。
如果设定的引物长度为 30mer,接下来需要计 算引物的 Tm值,看是否达到 78℃(GC含量 应大于40%)。
如果 Tm值低于 78℃,则适当改变引物的长度 以使其Tm值达到78℃(GC含量应大于40%)。
①设计上下游引物时确保突变点在引物的中央 位置。
②计算引物的 Tm值,看是否达到 78℃,如果 Tm值低于 78℃,则适当改变引物的长度以 使其Tm值达到78℃(GC含量应大于40%)。
③最好使用经过纯化的引物。 Tm值计算公式: Tm=0.41 ×(% of GC)-675/ L+81.5
注:L:引物碱基数;% of GC:引物 GC含量。

引物设计实例:

以GCG→ACG为例:
5'-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3'
①首先设计30mer长的上下游引物,并将A(T)设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5'-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’
Primer #2: 5'-GCAATAAGTAAGTCGTCTAATACTGAAGG-3'
②引物GC含量为40%,L为30,将这两个数值带入Tm值计算公式,得到其Tm=75.5(Tm=0.41×40-675/30+81.5)。通过计算可以看出其Tm低于78℃,这样的引物是不合适的,所以必须调整引物长度。
③重新调整引物长度。
Primer #1: 5'-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3'
Primer #2: 5'CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3'
在引物两端加5mer(斜体下划线处),这样引物的GC含量为45.7%,L值为35,将这两个数值带入Tm值,计算公式,得到其Tm为80.952(Tm=0.41×47.5-675/35+81.5),这样的引物就可以用于突变实验了。

实验前注意事项:

试剂盒提供了优化的实验方案,按步骤操作诱 导目的基因突变率几乎可达100%。

白色菌落的形成与突变效率是不同的,在实验 过程中重要的是出现白色单菌落而不是菌落出 现的数量。如果出现白色菌落则证明在目的基 因上已经发生了突变。有时由于MutazymeTM 处理步骤的失误,残留的模板质粒也能形成白 色菌落。但如果您操作无误,这种情况一般不会发生。
白色菌落的数量与突变率是没有直接关系的,而与PCR反应条件和感受态细胞转化效率有关。

如果突变没有出现在目的核苷上时,请检测合 成引物的纯度。

当PCR反应完成后,MutazymeTM酶的用量就 会影响到实验结果。若模板过量会产生阴性结 果,因此MutazymeTM和质粒模板的用量必须 适当。

试剂盒适用于15kb甚至大于15kb的模板突变, 但是当所用的质粒模板大于10kb时,白色菌落 数量会减少,不过这与突变效率没有关系。

定点突变操作步骤:
[A] 诱导突变基因(PCR反应)以待突变的质 粒为模板,用设计的引物及Muta-directTM酶进行 PCR扩增反应,诱导目的基因突变。

1. 设计点突变引物。
[注]参考引物设计指导

2. 准备模板质粒DNA
[注]用dam+型菌株(例如DH5 α菌株)作为宿主菌。在end+型菌株中常有克隆数低的现象,但是对突变效率没有影响。提取质粒DNA时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒。

3. [选项]对照反应体系(50μl反应体系)

10x reaction buffer 5μl
pUC18 control plasmid (10ng/μl,total 20ng) 2μl
Control primer mix (20pmol/μl 2μl
dNTP mixture(each 2.5mM) 2μl
dH2O 38μl
Muta-directTM Enzyme 1μl

4. 样品反应体系(50μl反应体系)

10x reaction buffer 5μl
Sample plasmid (10ng/μl,total 20ng) 2μl
Sample primer (F) (10pmol/μl) 1μl
Sample primer (R) (10pmol/μl) 1μl
dNTP mixture(each 2.5mM) 2μl
dH2O 38μl
Muta-directTM Enzyme 38μl

5. PCR反应条件
[注]按如下参数设置PCR扩增条件。

6. PCR扩增反应完成后冰育5分钟,然后置于室温 (避免反复冻融)。

[注] 按下列提供的PCR条件进行扩增,控制PCR循 环数。注意当突变点位点超过4个时会发生突变率 降低的现象。

[B] 突变质粒选择
PCR反应结束后使用MutazymeTM酶消化甲基 化质粒从而选择突变质粒DNA。

1. 准备PCR反应产物。

2. 加入1μl(10U/μl)MutazymeTM酶37℃温育 1小时。

[注]当质粒DNA用量过多时MutazymeTM酶可 能发生与样品反应不完全的现象。因此我们建议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作。如果 突变率低,可以适当延长反应时间或增加 MutazymeTM酶用量。

[C]转化
反应完毕后在质粒DNA上会产生缺口,当把 这个质粒DNA转入E.coli中时请选择dam+型菌株, 例如DH5α。

1. 将10μl样品加到50μl感受态细胞里,然后 放置在冰上30分钟。

2. 接下来可以参照一般的转化步骤进行。

序列分析:

通常当LB平板上出白色菌落则表明发生了突变。
为了证实这一结果,我们建议对白色单菌落进 行测序分析。

突变实例:

以GGC→GAC为例
[突变反应体系]

0×Reaction buffer 5μl
Sample plasmid (6.3Kb,10ng/μl,total 20ng) 2μl
Sample primer (F) (10pmol/μl) 1μl
dNTP mixture(2.5mM each) 1μl
dH2O 38μl
Muta-directTM Enzyme 38μl
[序列分析]
突变质粒测序结果
常见问题 解决方案
无单菌落出现 通过电泳检测PCR反应体系
如果是PCR反应的问题可以通过调节退火温度进行解决
检测感受态细胞的转化效率
突变率低 MutazymeTM酶处理不当
增加MutazymeTM酶用量或延长反应时间
检查模板质粒用量 质粒用量过多会引起突变率降低
错误突变 检测合成引物的质量