概述:

本试剂盒提供了一步法RT-PCR反应所需的全 部试剂，整个RT及PCR反应在同一体系中进行，中 间不需添加任何试剂。试剂盒中的AMV反转录酶 是由AMV分离而来的分子量约157,000道尔顿的 αβ型全酶。在AMV反转录酶作用下，可以完成由 RNA反转录为cDNA的过程，再由优化的Taq DNA 聚合酶扩增cDNA。一步法可使RT及PCR过程在 配方独特的10×RT-PCR缓冲液中一次完成，使操 作更加简便、快捷，并避免了中间加样可能发生的 污染。

试剂盒包装及组成:

操作方法：

每mg组织或106培养细胞的RNA产率轻轻混匀，短暂离心。45℃温育30~45min，95℃5min终止反应。进入以下30个循环： 94℃ 30s，60℃ 45s，72℃ 1~3min。最后72℃延伸7min。扩增完毕取5~10μl电泳。

常见问题及参考意见：

1、cDNA产量很低，为什么？可能的原因：
(1)RNA模板质量低；
(2)对mRNA 浓度估计过高；
(3)反应体系中存在反转录酶抑制剂 或反转录酶量不足；
(4)反应体积过大，一般不应超 过50μl。

2、合成不了长链的cDNA，为什么？
(1) RNA降解。对使用的器具、试剂用DEPC、干热或湿热灭菌处理，以杜绝RNase污染。同时，在逆转录反应中加入RNase抑制剂。
(2) 反应条件不合适。通过预实验确定最合适的反应条件，包括酶量、盐浓度、反应温度（37~56℃）及PCR反应条件等。
(3) RNA结构问题。提高逆转录反应温度。