概述:
本试剂盒提供了由总RNA或mRNA合成cDNA 第一链所需要的全部试剂,同时根据实验的不同要 求及目的提供了两种合成cDNA 第一链的引物:
oligo(dT)18和随机九聚物(dN)9。试剂盒中的M-MLV 反转录酶是一种依赖于RNA的DNA聚合酶,该酶 是鼠白血病毒的pol基因的产物,由分子量为71kD
的单个亚单位组成,具有很弱的RNase H活性。在 M-MLV反转录酶作用下,利用oligo(dT)18或者随机 引物(dN)9合成与mRNA相应互补的cDNA第一链。
目录号 |
规格 |
价格 |
FFS-25 |
25次 |
320元 |
试剂盒包装及组成: 25次
1. M-MLV Reverse Transcriptase(200U/μl) 2500U/12.5μl
2. 5×M-MLV Buffer 100μl
3. 100mM DTT 50μl
4. dNTPs(10mM each) 25μl
5. RNasin(40U/μl) 250U/6.25μl
6. Oligo(dT)18(20pmol/μl) 0.5OD/tube
7. (dN)9(20pmol/μl) 0.5OD/tube
8. DEPC-treated water 1.5ml
操作方法:
1、逆转录反应
(1)在无菌薄壁管中加入以下成份: Total RNA 0.5~1.0μg (dN)9 or oligo(dT)18 100pmol
(2)混匀后,70℃变性5min,将薄壁管迅速置于冰 上冷却,然后依次加入以下成份: 5×M-MLV Buffer 4μl dNTPs(10mM each)
1μl RNasin 10U100mM DTT 2μl M-MLV Reverse Transcriptase 100U DEPC-treated water
up to 20μl
(3)混匀后短暂离心,使用oligo(dT)18引物时在42℃, 使用随机引物(dN)9时在37℃下温育1小时。
(4)94℃ 5min终止反应后,冰上冷却。
(5)合成的cDNA第一链可直接用于PCR扩增或进 行其它下游操作。
2、PCR扩增
(1)在PCR薄壁管中加入以下试剂 Synthesized cDNA 2-5μl 10×PCR Buffer 2μl Upper primer 10pmol
Lower primer 10pmol dNTPs(10mM each) 0.5μl Taq DNA Polymerase 1.5U ddH2O up to
20μl
(2)混匀后短暂离心,然后进行PCR扩增。 94℃预变性2.5min。进入下列30~40个循环(此扩 增条件仅供参考):94℃ 30sec,60℃
45sec,72℃ 1min~3min。最后72℃延伸7min。
注意事项:
1、确保RNA完整性及纯度。RNA质量是决定合成 cDNA第一链成功的关键因素,其纯度及完整性 可由OD260/OD280比值和进行琼脂糖凝胶电泳检
测。较纯的RNA样品OD260/OD280比值通常为1.8 ~2.0,若该比值偏低,应进一步纯化。真核生物 RNA样品电泳图谱28s和18s的比值约为2:1,否
则,表明有RNA降解。
2、避免RNA酶污染。进行cDNA合成所用的器皿、 试剂和溶液必须完全无菌。操作过程始终戴手套以杜绝各种RNA酶的污染。 3、合成cDNA第一链的引物选择。选择oligo(dT)12-18
作为反转录引物,可保证cDNA具有完整的3'端, 通常可得到接近全长的cDNA第一链;若选择随 机寡核苷酸(dN)6或(dN)9作为引物,引物在整个
mRNA的多个位点退火,产生短的部分长度的 cDNA第一链。这种方法经常用于获得5'末端序 列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复
制的终止位点的RNA模板获得cDNA。
常见问题及参考意见:
1、cDNA产量很低,为什么? 可能的原因:
(1)RNA模板质量低;
(2)对mRNA 浓度估计过高;
(3)反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足;
(4)反应体积过大,一般不应超 过50μl。
2、合成不了长链的cDNA,为什么?
(1) RNA降解。对使用的器具、试剂用DEPC、干 热或湿热灭菌处理,以杜绝RNase污染。同时, 在逆转录反应中加入RNase抑制剂。
(2) 反应条件不合适。通过预实验确定最合适的反应 条件,包括酶量、盐浓度、反应温度(37~56℃)、 DTT浓度(0.5~10mM)。
(3) RNA结构问题。提高逆转录反应温度,或者使 用随机引物。
注:经本公司实验证明某些DEPC处理水可能 对Taq DNA聚合酶有抑制作用,因此PCR扩增时 建议最好使用超纯水。 |