概述:
该试剂盒综合了Redzol和硅胶膜离心纯化柱的优点,将二者有机地结合在一起,缩短了实验时间,简化了操作步骤,能更有效地去除DNA和蛋白质的污染,使提取的RNA纯度更高、产量更多。试剂盒中每个离心纯化柱每次可处理50~100mg组织或5~10×106个细胞,在45分钟内能同时处理多个样品。纯化的RNA可用于Northern杂交、RNA点
杂交、Poly(A)+mRNA的分离、体外转录、RT-PCR、 RNase封阻分析等。
目录号 |
规格 |
价格 |
FTRI-50 |
50次 |
220元 |
1、2泳道为Trizol试剂提取的总RNA;
3、4、5泳道为RNA提纯试剂盒提取的总RNA。
Redzol(一步法总RNA提取试剂)与总RNA提纯试剂盒提取大豆总RNA对比
试剂盒包装及组成:
1. Redzol试剂50ml
2. 硅胶膜离心纯化柱50套
3. RNA洗涤液40ml
4. DEPC处理水3ml
5. 产品说明书1份
实验前注意事项:
1. 经常更换新手套。因为皮肤和实验室用品上可能 有RNase,会导致RNase污染。
2. 吸头应用DEPC处理,避免交叉污染。
3. 应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿,用DEPC处理即可。
操作步骤:
1.准备
估算Redzol或组织细胞的用量。每1ml Redzol 的组织用量为50~100mg;细胞用量为5~10×106个 细胞
2.组织或细胞的裂解
贴壁细胞 吸尽培养液,加入Redzol,用移液器反复吹打 数次,确保全部裂解,然后转移至新的离心管中。裂 解10cm2细胞需要1ml Redzol。
注:Redzol的加入量不是根据细胞数目来决定,而 是根据细胞培养皿的面积(10cm2/ml)来决定。 悬浮细胞 离心收集细胞,吸尽液体,加入Redzol用移液
器吹打数次,确保全部裂解(某些酵母和细菌要用 匀浆器匀浆才能全部裂解),然后转移至新的离心 管中。按1ml Redzol可裂解5~10×106动物、植物、
酵母细胞或1×107细菌细胞的比例加入Redzol裂 解细胞。
注:应避免在Redzol加入前洗涤细胞,这样会增 加mRNA降解的几率。
组织 先将新鲜组织剪成小块,放入匀浆器内,加入 Redzol用匀浆器匀浆,然后转移至新的离心管中。或者将组织在液氮中研磨成粉末后,加入Redzol
中。每50~100mg的组织加入1ml Redzol进行裂解。
注:样品总体积不要超过所用Redzol体积的10%。
3.分相 a. 将匀浆液15~30℃静置5分钟使其充分裂解。 b. 每1ml Redzol中加入0.2ml的三氯甲烷(氯
仿),震荡混匀后15~30℃静置2~3分钟。 c. 12,000rpm离心15分钟。离心后混合物分成 三相(下面的酚/氯仿相、中间的白色界面、上面
的无色水相)。RNA全部在无色的水相中。 注:对于含有高浓度蛋白、脂肪、多糖或纤维素 (肌肉、脂肪组织、植物的微管组织)的样品,在
分相前可以附加一个分离步骤,匀浆后12,000rpm 离心10分钟弃沉淀。RNA溶解在上清液中,纤维 素、多糖、大分子量的DNA以不溶的形式沉淀从
而与RNA分离。对于脂肪组织的样品,上面一层 脂肪组织可以被清除掉,将清澈的匀浆液转移到 另一新管中,继续进行第3步分相。
4.柱纯化 a. 转移上层水相到另一新的1.5ml离心管中, 加入200μl无水乙醇,颠倒混匀。 b. 将混合液吸入离心纯化柱(硅胶膜)中,静
置3分钟,12,000rpm离心2~3分钟。 c. 倒掉收集管中的废液,将离心纯化柱重又套 入收集管中。加入600μl RNA洗涤液,12,000rpm离
心1分钟,倒掉收集管中的废液。 d. 12,000rpm再离心2分钟,尽量除尽液体。将 离心纯化柱套入干净的1.5ml离心管中,加入50μl DEPC处理的超纯水或0.5%
SDS于离心纯化柱正中 (不要粘在管壁上),静置1~2分钟,12,000rpm离心 1分钟。 e.
将洗脱液吸入离心纯化柱中再洗脱一次,以提高RNA的回收量。洗脱下来的液体即是纯化的 RNA,-20℃保存。
常见问题解答:
每mg组织或106培养细胞的RNA产率:
肝和脾6~10μg
肾3~4μg
骨骼肌和脑1~1.5μg
胎盘1~4μg 上皮细胞5~8μg
纤维原细胞5~7μg
RNA产率低:
样品裂解或匀浆不完全;提取的RNA溶解不 完全。
A260/A280<1.65:
紫外检测时RNA样品应用水稀释,不能用TE 稀释,低盐离子溶液和低pH值溶液致使其在280nm 的吸收值增加(Wilfinger, W. et. al,
Biotechniques 22: 474-481; Fox, D.K.(1998) Focus 20: 2 p.37);样品 匀浆时加入Redzol试剂体积太少,匀浆后溶液分层
不明显,水相被酚污染;最后提取的RNA样品不能 完全溶解。
RNA降解:
使用的动物组织没有被立即冻上或放入Redzol 中匀浆;分离使用的样品或制备的RNA长期贮存 在-5~-20℃,而不是贮存在-60℃~-70℃;提取RNA
的细胞被胰蛋白酶分解,易导致提取的RNA降解; 水相或使用的离心管仍残留有RNase;变性凝胶电 泳使用的甲醛pH值低于3.5。
DNA污染:
样品匀浆时加入试剂体积太少;分离使用的样品 含有有机溶剂(乙醇,DMSO等),盐离子或碱溶液。
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