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产品系列

概述:
一步法总RNA提取试剂Redzol是由酚与异硫氰 酸胍组成的均相溶液。不仅可直接用于从人类、动 物、植物、细菌等细胞或组织中提取总RNA,而且还可以从样品中提取DNA或蛋白质。纯化的总RNA完整性好,不受蛋白、DNA的污染。可用于Northern 杂交、RNA点杂交、poly(A)+mRNA的分离、体外转 录、RT-PCR、RNase封阻分析以及分子克隆。


目录号 规格 价格
FTR-50 50ml 150元

性能指标:
RNA产量一般为1-15μg RNA/mg组织或1×106 个细胞,A260/A280的比率一般在1.6~1.8之间。

使用优点:
操作简单:1小时即可完成整个RNA的提取,不仅 适用于小量组织(50~100mg)和细胞中(5×106) RNA的提取,还适用大量组织(>1g)和大量细胞 (>107)中RNA的提取。 纯度高:提取的总RNA不受蛋白、DNA等的污染。物美价廉:与其它进口同类产品相比质量相当,操作相同,但价格便宜将近一半。

物理特性:
红色透明液体,2~8℃保存,保存期限为12个月。 注意事项具有强的腐蚀性,若不慎接触皮肤,应立即用大量的洗涤剂和水进行冲洗;若感觉不舒适,应立即就诊。

注意事项:
具有强的腐蚀性,若不慎接触皮肤,应立即用大量的洗涤剂和水进行冲洗;若感觉不舒适,应立即就诊。

用户自备试剂:
1. 氯仿 2. 异丙醇 3. 75%乙醇(用DEPC处理的水) 4. DEPC水或0.5%SDS溶液

操作方法:
1.准备
估算Redzol或组织细胞的用量。每1ml Redzol的组织用量为50~100mg;细胞用量为5~106个 细胞。
2.组织或细胞的裂解
a、贴壁细胞
吸尽培养液,加入Redzol,用枪反复吹打数次,确保全部裂解,然后转移至新的离心管中。裂解 10cm2细胞需要1ml Redzol。 注:Redzol的加入量不是根据细胞数目来决定,而是根据细胞培养皿的面积(10cm2/ml)来决定。
b、悬浮细胞
离心收集细胞,吸尽液体,加入Redzol用枪吹打数次,确保全部裂解(某些酵母和细菌要用匀浆器匀浆才能全部裂解),然后转移至新的离心管中。按1ml Redzol可裂解5~10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞的比例加入Redzol裂解细胞。 注:应避免在Redzol加入前洗涤细胞,这样会增加mRNA降解的几率。
c、组织
先将新鲜组织剪成小块,放入匀浆器内,加入Redzol用匀浆器匀浆,然后转移至新的离心管中。 或者将组织在液氮中研磨成粉末后,加入Redzol中。每50~100mg的组织加入1ml Redzol进行裂解。 注:样品总体积不要超过所用Redzol体积的10%。
3.分相
a 将匀浆液15~30℃静置5分钟使其充分裂解。
b 每1ml Redzol中加入0.2ml的氯仿,震荡混匀后15~30℃静置2~3分钟。
c 2~8℃ 12,000g离心15分钟。离心后混合物分成三相(下面的酚/氯仿相、中间的白色界面、上 面的无色水相)。RNA全部在无色的水相中。 注:对于含有高浓度蛋白、脂肪、多糖或纤维素(肌肉、脂肪组织、植物的微管组织)的样品,在 分相前可以附加一个分离步骤:匀浆后2~8℃ 12,000g离心10分钟弃沉淀。RNA溶解在上清液 中,纤维素、多糖、大分子量的DNA以不溶的形式沉淀从而与RNA分离。对于脂肪组织的样品, 上面一层脂肪组织可以被清除掉,将清澈的匀浆 液转移到另一新管中,继续进行第3步分相。
4.沉淀RNA
转移上层水相到另一新离心管中,按0.5ml异 丙醇/1ml Redzol 比例加入异丙醇,充分混匀后 15~30℃静置10分钟,然后2~8℃ 12,000g离心10 分钟,RNA形成白色的小团沉淀在离心管的底部和 侧面。 注:一定不要吸取中间界面;若同时提取DNA和 蛋白质,于4℃保留下层酚相。
5.洗涤RNA
弃上清,RNA沉淀于管底。按1ml 75%乙醇/ 1ml Redzol加入75%乙醇,漂洗2~3次RNA沉淀, 2~8℃ 7,500g离心5分钟,尽量弃上清。
6.溶解RNA
在无菌工作台中干燥RNA沉淀5~10分钟。可用DEPC处理的50μl H2O、TE buffer 或0.5% SDS 溶解RNA样品,55-60℃温育10分钟使RNA完全溶解。注:RNA样品不要过于干燥,否则很难溶解。

常见问题解答
每mg组织或106培养细胞的RNA产率 :

肝和脾 6~10μg
3~4μg
骨骼肌和脑 1~1.5μg
胎盘 1~4μg
上皮细胞 5~8μg
纤维原细胞 5~7μg

RNA产率低:
样品裂解或匀浆不完全;提取的RNA溶解不 完全。

A260/A280k<1.65:
紫外检测时RNA样品应用水稀释,不能用TE 稀释,低盐离子溶液和低pH值溶液致使其在280nm 的吸收值增加(Wilfinger, W. et. AL, Biotechniques 22: 474-481; Fox, D.K.(1998) Focus 20: 2 p.37)。样品 匀浆时加入试剂体积太少,匀浆后溶液分层不明 显,水相被酚污染。最后提取的RNA样品不能完全 溶解。

RNA降解:
使用的动物组织没有被立即冻上或放入Redzol 中匀浆;分离使用的样品或制备的RNA长期贮存在 了-5~-20℃,而不是贮存在-60℃~-70℃。提取RNA的细胞被胰蛋白酶分解,易导致提取的RNA降解。水相或使用的离心管没有完全处理仍残留有RNase。 变性凝胶电泳使用的甲醛pH值低于3.5。

RNA污染:
样品匀浆时加入试剂体积太少;分离使用的样品含有有机溶剂(乙醇,DMSO等),盐离子或碱溶 液。

蛋白多糖和多糖污染:
改进RNA沉淀方法:起始匀浆中每加1ml的 Redzol,水相中加入0.25ml的异丙醇和0.25ml的高盐溶液(0.8M的柠檬酸钠,1.2M的NaCl),混匀,离心,接着进行下一步RNA的提取。此方法有效的 沉淀了RNA,而蛋白多糖和多糖仍保留在水相中。 为了从多糖含量高的植物材料中获得高纯度的 RNA,推荐采用改进的RNA沉淀和起始匀浆液离心这些步骤。