概述:
Taq DNA聚合酶是最常用的PCR酶,以Lambda
DNA为模板可以很好地扩增6kb的DNA片段,以人基因组DNA为模板可以很好地扩增2kb的DNA片段,但很难扩增更长的DNA片段。为了克服Taq
DNA聚合酶的这种缺陷,许多公司采用了各种各样的PCR系统,系统中包含Taq DNA聚合酶和有校对活性的耐热DNA聚合酶。而V-Taq
DNA聚合酶尤其适合复杂的长片段的扩增,它能扩增长至10kb 的动植物基因组DNA和20kb的Lambda DNA。与Taq
DNA聚合酶相比,V-Taq的另一个优点是酶活力更高,扩增效率明显高于Taq酶。因此,V-Taq
DNA聚合酶混合物是一种适用性更为广泛的酶,它能以各种DNA为模板,能扩增短片段的DNA也能扩增长片段的DNA,能扩增简单的DNA也能扩增复杂的DNA。
贮存:-20℃可稳定保存1年以上。
特性:
1. 较强的PCR扩增的保真性:V-Taq DNA聚合酶混合物中含有持续合成能力的Taq DNA聚合酶和具有校对活性的Pfu DNA聚合酶。
2. 提高了PCR扩增的产量:V-Taq DNA聚合酶混合物的精确调配增强了目的产物的扩增效果。
3. 更容易实现长片段PCR扩增:为扩增长片段的 PCR产物,V-Taq DNA聚合酶混合物和反应缓冲液均已最优化。
目录号 |
规格 |
价格 |
EVT-500 |
500U |
180元 |
适用范围:
标准PCR和长片段PCR
复杂模板的PCR
TA克隆和平末端克隆
试剂盒包装:
V-Taq DNA聚合酶 (5U/μl) 500units
10×PCR buffer (20mM Mg2+) 1.5ml
10×PCR Buffer:
300mM Tris-HCl(pH9.0)
300mM盐(包括K+和NH4+)
20mM Mg2+
PCR反应体系(以20μl体系为例):
DNA模板 |
1pg-1μg |
上游引物 |
5-10pmoles |
下游引物 |
5-10pmoles |
V-Taq DNA聚合酶(5U/μl) |
0.25-0.5μl |
10 × PCR buffer |
2μl |
dNTPs(2.5mM each) |
2μl |
无菌蒸馏水 |
至20μl |
扩增短片段和长片段的循环条件:
<10kb的循环条件
|
温度 |
时间 |
循环数 |
预变性 |
92-94℃ |
2-4 min |
1 |
变性
退火
延伸 |
94℃
45-65℃
72℃ |
15s-1min
15s-1min
1min/1-1.5kb |
25-30 |
最后延伸
保存 |
72℃ |
5-10min |
1 |
4℃ |
[注] :<1kb的片段延伸30s-1 min已足够 |
>10kb的循环条件
|
温度 |
时间 |
循环数 |
预变性 |
92-94℃ |
2-4 min |
1 |
变性
退火
延伸 |
94℃
45-65℃
72℃ |
15s-1min
15s-1min
1min/1-1.5kb |
10 |
变性
退火
延伸 |
94℃
45-65℃
72℃ |
15s-1min
15s-1min
1min/1-1.5kb+20s/cycle |
15-20 |
最后延伸
保存 |
72℃
4℃ |
5-10min |
1 |
PCR条件的优化:
为扩增特异的目的DNA片段,必须在适当的 范围内调整各个反应组份的浓度(时间、温度等参 数),以实现对特定片段的高效扩增。
模板DNA:
为扩增长片段目的片段,必须使用高质量的、完整的、高纯度的模板DNA。
引物:
PCR反应的引物是寡核苷酸,一般长度为15-30个碱基,它们与相应的DNA链杂交后引导底物与其侧面的目的DNA片段杂交。建议引物的G+C含量为40%-60%。
常见问题及参考意见:
常见问题 |
可能原因 |
参考意见 |
产物很少或
没有产物 |
引物
模板DNA存在问题
退火温度不合适
退火时间不合适
延伸时间太短
必要时采用热启动 |
-引物已降解或者引物浓度不够,需要优化引物浓度
-检查模板DNA的浓度、贮存条件及质量
-将退火温度2℃间隔递减
-退火时间应为30-60s
-将延伸时间延长1min
-采用手工热启动PCR或用热启动PCR酶 |
PCR产物有
多条带或条
带涂抹 |
退火温度太低
采用热启动
引物设计不合理
起始模板浓度太高 |
-将退火温度2℃间隔递增 |
|