首页 > 产品系列 > 核酸纯化 > 树脂型TMPCR产物纯化及胶回收试剂盒
产品系列

概述
本实验方法的基本原理是,在高盐、低pH值状态下,硅胶膜专一性地吸附DNA;而在低盐或水溶液状态下,DNA被洗脱下来。此法简便快捷,不仅用于从琼脂糖凝胶中纯化回收目的 DNA片段,也可用于PCR反应液的纯化、各种酶反应体系中DNA 片段的纯化、标记探针的回收及DNA样品的浓缩,整个过程只需几分钟,适用范围从几十bp到几十kb。500bp~3kb的片段,回收率达90%以上;200bp~500bp回收率达80%以上;200bp以下的片段回收率60%左右。



产 品 名 称 目 录 号 数 量 价 格
硅胶膜型TMPCR产物纯化及胶回收试剂盒 CSB-100 100次 170元



试剂盒包装及组成

? 100次
1. NE结合液 100ml
2. 硅胶膜离心纯化柱 100套
3. 产品说明书 1份


用户自备的仪器及试剂
1. 台式高速离心机
2. 1.5ml或2ml离心管及离心管架
3. 100μl、1000μl移液器及吸头
4. 80%异丙醇或80%乙醇
5. 超纯水或TE缓冲液

操作方法

一、从溶液中回收DNA片段

1. 往无石蜡油的PCR 反应液或其它酶反应液 (50~100μl)中加入3倍体积的NE结合液,颠倒混匀。然后将混合液转入离心纯化柱,静置至少5 分钟,使DNA充分与硅胶膜结合。13,000rpm离 心10~20秒,倒掉收集管中的废液。 适当增加DNA与硅胶膜结合的时间,使DNA与硅胶膜充分结合,能在一定程度上提高回收率。
2. 加入500μl的80%异丙醇(或80%乙醇)于离心纯化柱中,13,000rpm离心10~20秒,倒掉收集管中的废液。
3. 重复步骤2。
4. 13,000rpm再次离心1分钟,尽量除去残余异丙 醇或乙醇。
5. 将离心纯化柱置于新的离心管中,开盖放置2~3 分钟,使异丙醇(或乙醇)挥发殆尽。务必使异丙醇(或乙醇)挥发干净,否则影响其回收率及纯度。
6. 加入40~50μl无菌TE溶液或超纯水,静置3~5分钟,使洗脱液充分将硅胶膜浸透。 TE溶液或超纯水的用量视用户对DNA浓度的要求而定。将TE或超纯水50℃预热对提高回收率有一定帮助。
7. 13,000rpm 离心1 分钟,管底溶液即为所需的DNA。将DNA贮存于-20℃可长期保存。 离心纯化柱放入离心管中,若盖不上盖子,亦没有关系,可开盖离心。

二、从琼脂糖中纯化/回收DNA片段

1. 切取含DNA片段的琼脂糖后捣碎,按重量/体积 比1:3(琼脂糖重量:NE结合液的体积)加入NE结合液。如200mg琼脂糖加600μl NE结合液。将切取的琼脂糖捣碎有利于加速下一步凝胶的溶化
2. 50~60℃水浴3~5分钟,胶完全融化即可,其间可上下颠倒2~3次。
3. 将溶液转入离心纯化柱中,静置5分钟使DNA充 分与硅胶膜结合,13,000rpm离心10~20秒,倒掉收集管中的废液。 适当增加DNA与硅胶膜结合的时间,使DNA与硅胶膜充分结合,能在一定程度上提高回收率。
4. 加入500μl的80%异丙醇(或80%乙醇)于离心纯化柱中,13,000rpm离心10~20秒,倒掉收集管中的废液。
5. 重复步骤4。
6. 13,000rpm再次离心1分钟,尽量除去残余异丙醇或乙醇。
7. 将离心纯化柱置于新的离心管中,开盖放置2~3分钟,使异丙醇(或乙醇)挥发殆尽。务必使异丙醇(或乙醇)挥发干净,否则影响其回收率及纯度。
8. 加入40~50μl无菌TE溶液或超纯水,静置3~5分钟,使洗脱液充分将硅胶膜浸透。TE溶液或超纯水的用量视用户对DNA浓度的要求而定。将TE或超纯水50℃预热对提高回收率有一定帮助。
9. 13,000rpm离心1分钟,管底溶液即为所需的DNA。将DNA贮存于-20℃可长期保存。离心柱放入离心管中,若盖不上盖子,亦没有关系,可开盖离心。


常见问题及参考意见

常见问题 可能原因 参考意见
回收率低 洗脱液pH<7.0 用TE或pH>7.0的无菌超纯水洗脱
洗脱温度过低 加入50℃温育的无菌超纯水或TE浸透硅胶膜
回收片段过大或过小 最适宜的回收片段为100bp~5Kb
对于小于100bp的小片段,增大NE结合液的比例
回收的DNA片
段在后续实验
中出现问题(例
如连接失败)
盐的浓度过高 用80%乙醇漂洗回收产物
增加漂洗次数
残留有有机试剂 增加离心时间,将80%乙醇或异丙醇去除干净
部分双链DNA变性为单链DNA 在进行后续酶反应时,加入除酶以外的其它成份,95℃加热2分钟,缓慢冷却至室温(25℃以下),使单链DNA重新退火为双链DNA,然后加入酶,继续进行酶反应
用含有10mM NaCl的Tris Buffer洗脱DNA片段。
(注意:盐的浓度可能影响后续实验)

将约2μg的PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳后,切下DNA条带,然后使用本试剂盒纯化。取十分之一的量进行电泳检测,结果表明200bp以上的片段回收率大于80%。

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胶回收DNA片段电泳图 1%琼脂糖凝胶电泳(GoldView染色)
1. 胶回收的100bp片段
2. 胶回收的200bp片段
3. 胶回收的300bp片段
4. 胶回收的400bp片段
5. 胶回收的600bp片段
6. 胶回收的800bp片段
7. 胶回收的1,200bp片段
8. 胶回收的1,700bp片段
9. 胶回收的2,000bp片段
10. 胶回收的2,400bp片段
11. 胶回收的2,700bp片段
12. 胶回收的3,000bp片段