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  根据总重和HPLC分析的纯度,样品中目的肽的含量是如何确定的呢?我公司的多肽发货时是以总重来计算的,也就是肽冻干后的实际重量,其中包括在冻干过程中,其它杂质如残留的水分、来自带相反电荷离子的盐分等的重量。
   肽的纯度是指在波长214nm时样品中目的肽所占的比例,样品中可能含有缺失序列、短片段、脱保护不完全的序列等等。肽的纯度是在肽的最大吸收峰214nm处由HPLC分析而得到的,肽中一般还含有水分和盐分,但肽的纯度没有把它们计算在内。
   肽的含量是指所有肽在样品中所占的百分比,样品中包含所有的肽及水分、盐分等,肽的含量通过氨基酸分析得到。
   目的肽的绝对含量是指在样品中目的肽的纯度与其含量的乘积。

肽的溶解性


  以我们的经验,溶解肽是一个很重要的环节。如果溶解不当可能导致肽损失或者实验失败。肽的溶解性主要取决于肽的序列,所以,如果实验允许,肽序列中至少应包含20%的带电残基以增加其溶解度。?
   在使用之前,客户可以遵循以下三个基本原则来选择合适的溶剂溶解多肽。首先,所选溶剂一定能充分溶解多肽;其次,所选溶剂能与实验条件兼容;最后,所选溶剂不能与肽反应,也不能使肽降解。只要肽的量允许,可以先用少部分肽溶解,然后再将全部样品溶解。如果需要从溶剂中回收肽,可以选择一种初始溶剂使其在冻干后容易去除。?
   以下建议或许对您溶解肽有所帮助:?
   1. 少于5个氨基酸的肽一般溶于水溶液,强疏水的氨基酸(W,I,L,F,M,V,Y)除外。?
   2. 如果带电氨基酸平均分布于全部序列中,那么含有 >25%带电氨基酸(E,D,K,R,H)的亲水肽和含有<25%疏水氨基酸的肽一般都能溶于水溶液。多肽的纯化系统一般为0.1%TFA/水和0.1%TFA/ ACN。因此,如果肽溶解在没有缓冲能力或者缓冲能力很弱的缓冲液中,结果可能导致肽溶液呈酸性。在使用别的方法溶解肽时务必使溶剂的pH值近乎中性。酸性肽(E+D残基数多于K+R+H残基数)和碱性肽(K+R+H残基数多于E+D残基数)在中性pH值条件下比在酸性pH值下更易于溶解。
   3. 对于疏水氨基酸含量为50%~75%的肽,即使序列中含有 >25%带电氨基酸也有可能不溶于水或者部分溶解。最好先把肽溶于最少量的强有机溶剂如DMF、ACN、异丙醇、乙醇、乙酸、4-8M GdnHCl、尿素,或者DMSO(序列中没有C,W,M时),及其它类似的有机溶剂中。最好将溶解肽的有机溶剂缓慢地逐滴加入水溶液中,如果溶液变浑浊,可能是达到了溶解极限,继续溶解就没什么用了。需要注意的是,最开始选择的溶剂应该与实验系统兼容。?
   4. 疏水氨基酸含量 >75%的强疏水肽一般也不溶于水溶液。此类肽也应该先用强有机溶剂(如TFA,甲酸)溶解,如果将其加入到水溶液中也可能产生沉淀。最后的肽溶液可能需要高浓度的有机溶剂使之变性,而有机溶剂一般不用于活细胞的生物功能研究。?
   5. S,T,E,D,K,R,H,N,Q,Y含量高( >75%)的多肽序列容易形成多余的分子间氢键网络,在浓的水溶液中容易形成凝胶。此类肽可以用步骤3所述方法溶解。为了减少溶解中可能出现的问题,建议客户从设计上和序列上多加考虑,以改善肽的溶解度。

肽的溶解方法


  用哪种溶剂溶解合成肽一直是困扰多肽工作者的一个难题。根据不同的氨基酸序列,可以参考以下方法来溶解合成肽。最好是先将少量肽用水溶液溶解,不要一次将全部样品都溶解掉。?
   1. 将酸性氨基酸Asp (D),Glu (E)和C端-COOH的值定为-1。?
   2. 将碱性氨基酸Arg (R),Lys (K),His (H)的值定为+1。?
   3. 计算肽中全部电荷量。
   4. 如果肽的全部电荷为正值,则肽呈碱性,可以先用水溶解。如果肽不溶于水,可以用10%乙酸或者更高浓度的乙酸溶解。如果肽一点都不溶,加入TFA( <50ml)助溶,并用去离子水稀释至1ml。?
   5. 如果肽的全部电荷为负值,则肽呈酸性,可以先用水溶解。如果肽不溶于水,加入NH4OH( <50ml) 助溶,并用去离子水稀释至1ml。?
   6. 如果肽的全部电荷为0,则肽呈中性。中性肽需要用乙腈、甲醇、异丙醇等有机溶剂来溶解,也可以加入变性剂(如尿素、盐酸胍等)。 
实例:    KRLMKSIEVIMPL: (+4) + (-2) = +2。此条肽呈碱性。见以上步骤4。
       LVKMKSIEDPDCE: (+3) + (-5) = -2。此条肽呈酸性。见以上步骤5。
       MVSRKDLVEHRDM: (+4) + (-4) = 0。此条肽呈中性。见以上步骤6。

肽的贮存


  贮存时间太长的多肽样品可能出现一些问题。冻干多肽通常稳定性较好,一般来讲冻干多肽在-10℃ 或更低温度条件下能贮存几年而不会降解。但如果以溶液状态保存,其稳定性就会受到影响。由于多肽会被微生物、细菌和蛋白酶降解,因此最好用无菌溶液溶解多肽,可以用无菌水、蒸馏水溶解,或者溶解后过滤除菌。对于那些含有Met、Cys、Trp的肽,由于氧化作用会产生其它杂质或使其丧失生物学活性,因此,含有上述氨基酸的肽应该用无氧溶剂溶解。?
   关于溶剂的pH,多数肽在酸性条件下比较稳定。建议溶剂的pH范围为3~6,溶解的多肽最好分装后冷冻保存,避免反复冻融。为保持肽的稳定性,建议多肽最好以冻干粉状态保存。

常见问题及参考意见


Q:赛百盛对本公司的产品是如何监控的?
A :所有合成肽都经过HPLC和MS分析,除MALDIMS 外,由于肽在不同的质谱仪中,能按其本身的序列进行离子化,我们可以运用HPLC-MS技术对HPLC中那些离子化的峰进行分析。我公司的技术装备[MALDI-MS,HPLC-(ESI)MS(离子阱和四极管阵列)]为分析提供可靠的保证。

Q:请介绍一下你们的纯化策略
A:我公司合成的多肽是用制备型反相HPLC进行纯化的,所用的两种流动相中都添加了TFA,pH 2。A相是0.1% TFA于超纯水中,B相是0.1% TFA 于ACN 中,pH 2。样品可以直接用A相溶,或者先用少量B相溶解再用A相稀释。有时可能需要用强溶剂如甲酸、乙酸来溶解疏水肽,具体采用哪种方法要看肽序列。在pH 6.8 时一般很难将肽溶解也很难进行纯化,因此我们一般是先将肽溶解再用两种流动相进行梯度洗脱。所用的pH 6.8的缓冲液为10 mM醋酸铵于超纯水中(流动相A),纯ACN(流动相B)。通过紫外检测器在214 nm处检测,收集不同组分并用MADLI-TOF MS进行成分鉴定,用反相 HPLC分析纯度,然后把目的肽冻干,将冻干的肽合并装入小瓶中,最后,再对合并后的产物进行MS和HPLC分析。

Q:如何解释MALDI(MS)中的P+Na 和P+K峰?
A:经常会在MALDI中看到Na峰和K峰,钠和钾来源于溶剂水。即便是蒸馏水和去离子水也会含有痕量的钠离子和钾离子,无法完全除去。它们在进行质谱分析时也会离子化并与肽的自由羧基结合。因为没有纯化水的系统将水中的钠离子和钾离子除去,所以有时候在MALDI MS图谱中出现钠峰和钾峰也是再所难免的。

Q:合成肽在长度上有何限制?
A:我公司合成的多肽长度为6~50个氨基酸。标准的固相合成程序一般能合成6~50个氨基酸的多肽。

Q:肽的纯度能达到多少?我的实验需要多少纯度?
A:我公司可以提供不同的纯度级别供客户选择,从粗品到>98%纯度。根据客户需要我们可以提供纯度>98%的超纯多肽。各种纯度及应用范围如下:>70%,用于免疫实验和不敏感的筛选实验 >80%,用于免疫实验和不敏感的筛选实验 >90%,用于SAR研究和生物检测 >95%,用于NMR,晶体结构研究及生物检测 >98%,用于NMR,晶体结构研究及敏感的生物检测

Q:什么是净重?什么是肽含量?
A:肽冻干后一般呈现为蓬松的绒毛状,由于肽本身的特性决定了其中可能仍然含有痕量的水分、吸附的溶剂及盐分等。这不代表肽的纯度不够,仅仅是影响肽的实际含量,使其降低了10%~30%。肽的净重是指肽的实际重量减去水分和质子化离子后的重量。为保证肽的浓度,需要从粗品肽中把非肽物质去除。

Q:赛百盛如何运输多肽?都提供哪些检测报告?
A:所有冻干的多肽都盛放在2 ml或10ml的螺旋盖小塑料管里,都附带有原始的分析数据和合成报告单,上面包含有多肽的序列、分子量、纯度、重量、编号等重要信息。

Q:什么样的保存条件是最好的?多肽的稳定性怎样?
A:多肽冻干后呈绒毛状或絮状粉末,可避免多肽的过早降解。建议贮存条件为: a. -20℃贮存或者在干燥环境中贮存 b. 尽量避免反复冻融 c. 尽量避免以溶液状态贮存(为使用方便可以将冻干粉分装后贮存) d. 如果必须以溶液状态贮存,建议用无菌水在弱酸性条件下溶解多肽并于-20℃贮存.

Q:如何溶解多肽?
A:多肽的溶解度主要取决于其一级结构和二级结构,修饰标记的性质及溶剂类型和终浓度。如果肽难溶于水,超声可以助溶。对于碱性肽,建议用10 % 乙酸溶解;对于酸性肽,建议用 10%NH4HCO3溶解。不溶于水的多肽也可以添加有机溶剂助溶。用最少量的有机溶剂(如 DMSO、DMF、异丙醇、甲醇等)将肽溶解,强烈推荐先将肽溶于有机溶剂中,然后缓慢加入水或其它缓冲液直至所需浓度。

Q:赛百盛能合成哪些修饰标记的多肽?
A :我公司提供多种修饰标记的多肽,如乙酰化、生物素标记、磷酸化修饰、荧光修饰,也可以根据您的特殊需要定制不同的修饰。

Q:哪种末端最适合我的研究?
A:肽的末端默认为N端游离的氨基,C端游离的羧基。而肽的序列往往代表了母本蛋白的序列,为了与母本蛋白更为接近,肽末端往往需要封闭,即N端乙酰化,C端酰胺化,这种修饰避免引入多余电荷,也使其更能防止外切酶作用,使肽更加稳定。

Q:为什么要进行N端乙酰化,C端酰胺化修饰?
A:这些修饰可以使肽不会被降解掉,也可以使肽模拟它在母本蛋白中α氨基和羧基的原始状态。?

Q:就磷酸化肽的设计能不能给出一些建议?
A:随着长度的增加,从磷酸化的那个氨基酸往后偶联效率逐渐降低。合成方向从C端到N端,建议磷酸化的那个氨基酸以后的残基不要超过10 个,也就是说从N端往C端数磷酸化氨基酸之前的氨基酸残基最好不要超过10个。

Q:如果想在N端做生物素修饰,需要在生物素和肽序列之间加一个间隔吗?
A :我公司采用的标准的生物素标记程序是先往肽链上连一个Ahx,然后再连生物素。Ahx是一个6碳化合物,把它加在肽和生物素之间起到间隔的作用。

Q:是不是在肽和修饰标记的染料之间都需要加一个间隔?
A:如果你打算将一个大分子(如某种染料)连到肽上,最好在肽和配体之间设一个间隔,以尽量减少肽本身的折叠作用或者其偶联物的折叠作用对受体造成的干扰。也有人不希望间隔的存在,例如,在蛋白质的折叠研究中,可以通过确定将荧光染料连在某个氨基酸的某个位点上来研究二者在折叠结构上相距多远。

Q:我需要合一条环肽,其中含有一个色氨酸,它会被氧化吗?
A:色氨酸的氧化是肽氧化中的常见现象,而肽一般是先环化再纯化,如果其中的色氨酸发生了氧化作用,肽在HPLC柱上的滞留时间会发生变化,氧化可以通过纯化去除。再者,氧化的肽也可以通过MS检测到。

Q:如何确定肽已成环?
A :我们用Ellman反应来检测成环反应是否完全。如果Ellman检测结果为阳性(黄色),说明成环反应不完全;如果检测结果为阴性(不是黄色),说明成环反应已进行完全。我们对客户不提供环化鉴定的分析报告,一般在QC报告单中会有关于Ellman检测结果的描述。

Q:含有Cys的多肽在出货前经过还原了吗?
A :如果没有发现肽已经被氧化,我们一般不对Cys 进行还原。所有的多肽都是由粗品在pH2条件下纯化、冻干后得到的,这样的pH条件至少在某种程度上防止了Cys的氧化。含Cys的肽一般在pH2条件下进行纯化,除非有特殊原因需要在pH6.8条件下纯化。如果纯化在pH6.8进行,纯化产物必须马上用酸处理以防氧化。在最后的质量控制环节,对于含有Cys的肽,如果MS 图谱上发现有分子量为(2P+H)的物质存在,说明已形成二聚体。如果MS和HPLC都没有问题,我们就直接冻干后出货,无须再做任何处理。需要指明的是,含有Cys的肽随着时间的推移会发生缓慢的氧化,氧化程度主要取决于肽序列及贮存条件。